مشاركة المقالة. إنشاء طريقة الكشف عن فيروس الريبودوفيروس الميكروبتروس سالمويديس على أساس نظام كريسبر/كاس13أ

‬إنشاء طريقة للكشف عن فيروس Micropterus salmoides rhabdovirus على أساس نظام CRISPR Cas13a‬

张敏琳, 黄??, 左小??, 梁建??, 梁凯珊, 单金红, 李宗??, 喻??, 罗丽??, ??杰, ?? 会宏, 王庆. 基于CRISPR/Cas13a系统建立大口黑??弹状病毒检测方法[J]. 水生生物学报, 2024, 48(2): 283-291.2023.0199

ميكروبتروس سالمويديس، المعروف أيضا باسم كاليفورنيا باس أو أمريكا الأسود باس، هو سمك مياه عذبة من أصل أمريكا الشمالية. في السنوات الأخيرة،أصبحت سمكة مهمة في جميع أنحاء العالم بسبب الطلب الكبير على السوق: micropterus salmoides لديها لحم صلب، عدد قليل من العظام، طعم لذيذ، تغذية غنية، وخاصة عالية البروتين وقليلة الدهون، والتي تلبي طلب المستهلكين على الغذاء الصحي.سعر السوق مرتفع نسبياً وغالباً ما يستخدم في سوق المطاعم الراقيةالنمو السريع: Micropterus salmoides ينمو بسرعة ويمكن أن يصل بشكل عام إلى مواصفات السلع في غضون 6-8 أشهر. وهو مناسب لتربية دورة قصيرة ويمكن أن تحقق بسرعة عوائد الاستثمار.مقاومة قوية للأمراض: بالمقارنة مع الأسماك المزرعة الأخرى ، يمتلك سمك الميكروبتروس سالمويديس قدرة قوية على التكيف مع البيئة ، وانخفاض تفشي الأمراض على نطاق واسع ، والحد من مخاطر التكاثر.يمكن أن يختلط السمك البحري مع أسماك المياه العذبة الأخرى مثل السمك الفضي وسمك العشب، مما يساعد على تحقيق التوازن البيئي للبحيرة وتعظيم استخدام الموارد، وتحسين كفاءة التكاثر وغيرها من العوامل.و نطاق تربيته قد نمت بسرعة في السنوات الأخيرة.

على الرغم من أن الميكروبتروس سالمويديس مقاومة نسبياً للأمراض، إلا أنها قد تعاني من بعض الأمراض في ظل ظروف تربية سيئة.ميكروبتروس سالمويديس رابدو فيروس (MSRV) ضار للغاية: تم اكتشافه لأول مرة في فلوريدا، الولايات المتحدة الأمريكية في عام 1991. تم اكتشاف الفيروس في البداية في سكان البحر الكبير،ثم انتشر تدريجياً إلى العديد من البحيرات والخزانات في الولايات المتحدة، تصبح واحدة من المسببات المرضية الرئيسية للسمك الكبير.

الأعراض السريرية للأسماك المريضة

أ: السهم يشير إلى كيس الصفراء. ب: السهم يشير إلى كيس الصفراء.

مصدر الانتقال غالبا ما يكون سمك الفراولة أو السمك البالغ المصاب، ومسطحات المياه الملوثة، والأسماك البرية الحاملة للفيروس. يمكن أن ينتقل هذا الفيروس عن طريق الاتصال المباشر، والإفراز البراز،ومسطحات المياه، ويكون أكثر عرضة للظهور في ظل سوء نوعية المياه أو ظروف التكاثر عالية الكثافة. الانتشار. يمكن أن يسبب الفيروس الخمول والهجرة وتورم البطن وتشوه الجسم في الأسماك الشابة,كما تسبب القرحة الميتة والنزيف متعدد الأعضاء. مرة واحدة مصابة، معدل الوفيات يتجاوز 90٪.

الأعراض السريرية لميكروبتروس سالمويديس المصابة بشكل مصطنع

أ: سمك السمك الصحي، ب، ج، د: سمك السمك الصناعي.

في كل عام، يفقد أكثر من 30٪ من سمك ميكروبتروس سالمويديس بسبب فيروس MSRV. في الوقت الحالي، لا تزال طرق العلاج والكشف عن الفيروس غير ناضجة،ولا يوجد دواء محدد لعلاجهولذلك، فمن الضروري للغاية اكتشاف الفيروس في الوقت المناسب قبل الإصابة واتخاذ تدابير وقائية فعالة، والتي يمكن أن تقلل من الخسائر في عملية التكاثر إلى حد ما.

وبالإضافة إلى ذلك، من الصعب إجراء الكشف في الموقع دون معدات الكشف المعقدة مع تكنولوجيا الكشف القائمة.فريق البحث في جامعة جنوب الصين الزراعية قد طورت طريقة كشف جديدة تجمع بين MIRA مع نظام CRISPRهذه الطريقة لديها خصائص قوية، حساسية عالية وسهلة التشغيل،والذي يحسن إلى حد كبير من كفاءة الكشف عن MSRV ويساعد أيضا في الكشف عن MSRV في وقت مبكر ممكن واتخاذ تدابير الوقاية والسيطرة.

المنتجات المستخدمة في هذه المادة: مجموعة التضخيم السريع لـ RNA Isothermal (النوع الأساسي) -II

فحص مزيج البرايمر بواسطة MIRA

تم استخدام زوجين من أساسيات MIRA المختلفة لتضخيم شظية الجينات التي تحتوي على تسلسل الهدف ، وتم إخضاع المنتجات المضخمة للكهرباء الكهربائية الجل الجاروز.تم تحديد الرسم البياني للكهربافوريزة في موقع 100 bp، وظهرت أشرطة مشرقة في جميع الممرات الثلاث، مما يشير إلى وجود منتجات تضخيم غير محددة.تم تحليل نطاقات الهدف المعززة عند 250 bp في الممرين 2 و 3 على التوالي كميا بواسطة برنامج Image J، و تم التعبير عن نتائج التحليل الكمي عن طريق "القيمة الرمادية". من نتائج التحليل ، يمكن استنتاج أنه كلما كانت القيمة الرمادية أقل ، كلما زاد معدل استخدام البرايمر ،هذا هو، كلما زادت كفاءة تضخيم الربط المحدد للبرامر.

أظهرت النتائج أن كفاءة تضخيم الارتباط المحدد كانت مرتفعة عند استخدام زوج MIRA- F2 / R2.

صورة جيل الكهربافوريزة لـ MIRA للفحص المكامل للزوجين وتحليل القيمة الرمادية

مسار الكهرباء M: 2000 bp DNA marker؛ مسار الكهرباء 1. تضخيم عينة الحمض النووي السلبي؛ مسار الكهرباء 2.زوج MIRA-F1 / R1 الأساسي يضخم الشظية المستهدفة (224 bp كما هو موضح في الصندوق)· محيط التشغيل الكهربائي 3. MIRA-F2 / R2 الزوج الابتدائي يضخم القطعة المستهدفة (255 bp كما هو موضح في الصندوق) ؛ ب. تحليل قيمة الرمادية النطاق (كما هو موضح في الصندوق)

نظام الكشف CRISPR/Cas13a

بعد الانتهاء من تفاعل نظام الكشف CRISPR/Cas13a، يتم إشعاعه بالضوء فوق البنفسجي لمراقبة النتائج.

مخطط سطوع نظام الكشف CRISPR/Cas13a - الفلوريسنت

1- 3- النظام بأكمله مع إضافة معيار الحمض النووي الريبوزي؛ 4- لا إضافة الحمض النووي الريبوزي؛ 5- لا إضافة بروتين Cas13a؛ 6- لا إضافة مسبار مراسل ssRNA؛ 7- التحكم السلبي

نظام الاستجابة المثلى CRISPR/Cas13a-MSRV

قمنا بإجراء تجارب باستخدام معايير الحمض النووي الاصطناعي (RNA) و (amplified sample RNA) سرعة تحديد موقع الحمض النووي الاصطناعي المستهدف كانت أفضل مع (crRNA2) من (crRNA1)كان لـ crRNA1 إشارة فلوريسنسية نهائية أقوى من crRNA2يمكن أن يجمع الاستخدام المختلط لـ crRNA1 + crRNA2 بنسب متساوية بين مزايا كليهما ويحقق كفاءة تفاعلية أفضل.

تحسين ظروف رد الفعل للكشف عن CRISPR/Cas13a-MSRV ونتائج الكشف

a. مقارنة نتائج الكشف عن الحمض النووي الريبوزي القياسي باستخدام الحمض النووي الريبوزي الريبوزي مع تسلسلات الفاصل المختلفة.

ب. مقارنة بيانات إشارات الفلوريسنس من الحمض النووي الريبوزي القياسي التي تم اكتشافها بواسطة نظام الكشف عند درجات حرارة مختلفة.

ج. مقارنة بيانات إشارات الفلوريسنس من الحمض النووي الريبوزي القياسي المكتشف باستخدام أجهزة رصد الحمض النووي الريبوزي مع تركيزات مختلفة.

d. مقارنة نتائج الكشف عن الحمض النووي الريبوزي القياسي التي تم الكشف عنها باستخدام مجمعات المسبار Cas13a/crRNA مع نسب تركيز مختلفة.

لاستكشاف تأثير درجة حرارة التفاعل على نظام الكشف ، تم تعيين درجات حرارة تفاعلية مختلفة تبلغ 31 درجة مئوية و 34 درجة مئوية و 37 درجة مئوية و 41 درجة مئوية.كانت درجة حرارة التفاعل المثلى لنظام الكشف عن CRISPR/Cas13a-MSRV 37 درجة مئوية.

لاستكشاف تأثير تركيز مسبار ssRNA على نظام الكشف، ضمن نطاق الاختبار،كانت كثافة الالوميض مرتبطة بشكل إيجابي مع تركيز مسبار المراسل ssRNAلم يكن تأثير الكشف عن تركيز مسبار مراسل ssRNA مختلفًا كثيرًا عند 500-700 nmol / L. بالنظر إلى المشاكل الاقتصادية الفعلية ،كانت التركيز المثالي لجهاز المسبار المراسل لـ ssRNA 500 nmol/L.

لاستكشاف تأثير نسبة تركيز رد فعل Cas13a و crRNA المختلفة على نظام الكشف، عندما كانت نسبة Cas13a: crRNA 4:1 و 3:1 بناءً على نسبة 100 nmol/L لكل جزء،تم الوصول إلى الامتلاء بـ Cas13aعندما كانت كمية Cas13a ثابتة، لم تكن كثافة إشارة الفلوروسانس مرتبطة بشكل إيجابي بزيادة كمية crRNA.عندما تكون نسبة Cas13a إلى crRNA 2:1، يمكن لنظام الكشف عن CRISPR/Cas13a-MSRV تحقيق أقصى نشاط كشف.

تقييم الحساسية

من أجل استكشاف الحد الأدنى لتركيز الكشف عن MSRV بواسطة نظام الكشف عن CRISPR/Cas13a-MSRV ،تم تخفيف معيار الحمض النووي الريبوزي 10 مرات في سلسلة وتم الكشف عنها بواسطة نظام الكشف CRISPR/Cas13a-MSRVيمكن لنظام الكشف عن CRISPR/Cas13a-MSRV الكشف عن 100fM على الأقل من RNA الهدف من MSRV. عندما تكون تركيز RNA الهدف أقل من 100fM،لا تختلف إشارة الفلوريسنس التي اكتشفتها الآلة بشكل كبير عن إشارة التحكم في الفراغ.لذلك، يمكن لنظام الكشف عن CRISPR/Cas13a-MSRV الكشف عن 100fM على الأقل من ssRNA MSRV.

تقييم خصائص نظام كريسبر/كاس13أ-MSRV للكشف عن MSRV

اختبار العينات

بالنسبة لعينات الأسماك المريضة مع علامات واضحة من المرض التي تم جمعها من مزارع السمك البحري، تحققنا مما إذا كان المسبب المصاب بالأسماك المريضة هو MSRV.لقد استخدمنا البرايمر المحدد لسلسلة بروتين الكبسيد MSRV لتضخيم PCRبعد المقارنة، أكدنا أنّه (إم إس آر في).

تأكيد معلومات تسلسل MSRV

a. تضخيم PCR لمجموعة منتجات 228 bp من أساسيات MSRV. b. تسلسل بروتين الكبسيد MSRV مقارنة مع NCBI ، التسلسلات المكتظة هي مواقع ربط أساسي في المدافع العليا والأسفل ،والمناطق المظللة هي المواقع المستهدفة لربط CRISPR/Cas13a-MSRV crRNA1

عينات الأسماك المريضة المصابة بفيروس MSRV تم معالجتها مسبقاً وتضخيمها مسبقاً للحصول على الحمض النووي الريبوزي الفيروسي، ومن ثم اختبارها مع مجموعة التحكم السلبية.تم استخراج cDNA من العينات للمقارنة مع qPCR التقليديةكانت العينات الإيجابية (رقم 3، 6، 7، 8، 9، 12، 13، 14 و 15) التي اكتشفها نظام الكشف عن CRISPR/Cas13a-MSRV هي نفس نتائج QPCR التقليدية.حيث كانت قيمة CQ لـ qPCR بين 18 و 25في حين أن عدد الحد الأدنى لدورة العينات السلبية (رقم 1، 2، 4، 5، 9، 10 و 11) كان أكبر من 38، مما يشير إلى أن العينات لم تحمل فيروس MSVR.كانت بيانات الكشف من نظام كشف CRISPR/Cas13a-MSRV والRT-qPCR التقليدي متسقة، مما يشير إلى أن نظام الكشف عن CRISPR/Cas13a-MSRV ممكن ويمكن أن يحل محل طرق الكشف التقليدية والمعقدة الأصلية إلى حد ما.

مخطط مقارنة رأسية لبيانات الكشف عن qPCR العينة مع qPCR و CRISPR

a. اكتشاف qPCR لرسم بياني لعدد دورة عينة MSRV السريرية ؛ تم مقارنة عدد دورة العينة المكتشف مع رقم دورة المرجعية السلبية باستخدام تحليل الاختبارات T (**P<0.01) ؛

ب. Cas13a جنبا إلى جنب مع الكشف عن MIRA من MSRV مخطط لضوء العينة السريرية.تم مقارنة قيمة فلوريسانس العينة المكتشفة مع قيمة فلوريسانس المرجعية السلبية باستخدام تحليل اختبارات T (**P<0.01)

باختصار، فإن طريقة الكشف عن CRISPR/Cas13a-MSRV التي وضعت في هذه الدراسة لا تتطلب أدوات تجريبية مكلفة، مما يجعل الكشف في الموقع سريعًا ودقيقًا ومريحًا.إذا تم استخدام طريقة الكشف هذه للكشف في الوقت المناسب عن MSRV في عملية التكاثر الفعلية واتخاذ تدابير مستهدفة وفعالة، يمكن أن يقلل إلى حد كبير من الخسائر الناجمة عن الأمراض في عملية التكاثر.ولها آفاق كبيرة للتطبيق والترويج.